內(nèi)皮糖萼由糖胺聚糖組成，包括透明質酸（HA）、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素和唾液酸，是一種位于內(nèi)皮細胞頂端表面的糖蛋白復合物。該層有助于血管壁的屏障特性，并參與機械感應和剪切力到內(nèi)皮的轉導。

剪切應力是指血流與血管內(nèi)皮間摩擦力。高剪切應力（HSS，12-15 dyn/cm²）已被證明可以維持內(nèi)皮糖萼的完整性并抵抗早期動脈粥樣硬化病變的發(fā)展。然而，低剪切應力（LSS，<5 dyn/cm²）也被認為通過減少內(nèi)皮糖萼的尺寸在早期動脈粥樣硬化中起關鍵作用。

研究發(fā)現(xiàn)，LSS 通過透明質酸酶2（HYAL2）途徑降解內(nèi)皮糖萼內(nèi)的 HA，并進一步證明 LSS 誘導的糖萼損傷導致 eNOS-Ser633 去磷酸化并減少 NO 產(chǎn)生。然而，LSS如何激活HYAL2仍不清楚。Na⁺-H⁺交換劑(NHE1)催化細胞內(nèi)H⁺離子的排出以交換細胞外Na⁺離子，是可能的候選者之一，并且是一種普遍存在的膜蛋白，可調(diào)節(jié)細胞pH值。有研究發(fā)現(xiàn)，NHE1被激活以產(chǎn)生酸性細胞外微環(huán)境，導致HYAL2在人乳腺腫瘤細胞中激活。據(jù)報道，在內(nèi)皮細胞中，HSS可引發(fā)AMPK磷酸化并增加AMPK的活性，AMPK在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)pH值中起重要作用。AMPK是否通過細胞外基質的NHE1酸化參與LSS誘導的HYAL2活化仍有待確定。

因此，南京醫(yī)科大學南京第一醫(yī)院心內(nèi)科的專家學者進行了研究，使用功能喪失方法和AMPKα、NHE1和HYAL2的激活或失活，旨在確定LSS誘導的內(nèi)皮糖萼損傷和早期內(nèi)皮炎癥對LSS的影響和分子機制。文章為《AMP-activated protein kinase regulates glycocalyx impairment and macrophage recruitment in response to low shear stress.》

圖1 平行平板流動室示意圖
實驗中的LSS為2 dyn/cm²，HSS為15 dyn/cm²。

NHE1 介導 LSS 誘導的糖萼損傷

LSS激活NHE1的機制是否涉及AMPK，以及NHE1在LSS誘導的糖萼損傷中的作用尚不清楚。實驗首先在細胞經(jīng)受LSS 5、15、30和60min后檢查了NHE1蛋白及其磷酸化以及NHE1的活性。未經(jīng)LSS處理的細胞用作對照。

盡管表面NHE1蛋白表達沒有顯著變化，但在LSS暴露15min后，NHE1磷酸化水平顯著升高，在30min時達到最高水平。NHE1活性早在LSS處理后15min就增強并持續(xù)至少60min。

為了確認NHE1活性對響應LSS的糖萼損傷的影響，在LSS暴露之前，用編碼顯性陰性形式的酶 (AdDN-NHE1) 的腺病毒轉導HUVECs，或用靶向NHE1活性的cariporide（卡立泊來德）預處理。使用AdDN-NHE1抑制NHE1活性顯著降低了 LSS誘導的NHE1磷酸化和NHE1活性。除了AdDN-NHE1外，cariporide也可抑制NHE1活性。

接下來，使用AFM檢查內(nèi)皮糖萼厚度（GCT）。糖萼的最大厚度為628nm。LSS顯著稀釋了內(nèi)皮糖萼，然而，使用AdDN-NHE1可抑制NHE1活性，或cariporide保護糖萼免受LSS誘導的GCT降低。

AMPK調(diào)節(jié)NHE1依賴性糖萼損傷以響應LSS

實驗顯示了AMPKα在其激活位點Thr172磷酸化的下調(diào)，伴隨著AMPK活性的降低，這在LSS處理后15min就很明顯，并且持續(xù)了至少60min。相反，AMPKα蛋白表達無明顯變化。為了檢查AMPK的失活是否介導LSS誘導的NHE1活化和糖萼降解，在沒有或存在AMPK激活劑ampkinone的情況下，將HUVECs暴露于LSS30min。在接受30minLSS的細胞中，用ampkinone處理恢復了AMPKα-Thr172磷酸化水平以及被LSS下調(diào)的 AMPK 活性。Ampkinone處理還阻止了響應 LSS的NHE1磷酸化和NHE1活性的增加。

在平行實驗中，在LSS暴露前30min用AdCA-AMPKα轉導HUVECs。組成型活性AMPKα不僅恢復了由LSS抑制的AMPK活性，而且減弱了LSS誘導的NHE1磷酸化和NHE1活化。然而，使用AdDN-NHE1抑制NHE1活性既不會減弱AMPKα-Thr172去磷酸化，也不會逆轉LSS誘導的AMPK失活。

接下來研究了AMPK在LSS誘導的HUVECs糖萼損傷中的作用。HUVECs與AMPK激活劑ampkinone的孵育顯著減弱了LSS誘導的糖萼損傷。為了進一步證實AMPK活性對LSS下內(nèi)皮糖萼損傷的影響，在HUVECs中表達了AdDN-AMPKα或AdCA-AMPKα。觀察到AdCA-AMPKα保護糖萼免受LSS誘導的損傷。然而，AdDN-AMPKα顯著逆轉了HSS誘導的糖萼保護。結果顯示cariporide、ampkinone、AdDN-NHE1和AdCA-AMPKα顯著阻止糖萼中HA表達降低和糖萼變薄以響應LSS。這些結果表明LSS引起的AMPK失活介導了內(nèi)皮糖萼損傷。

之前的研究表明，HYAL2參與了響應LSS的糖萼損傷。在該實驗中，研究人員證實了LSS激活HYAL2降解內(nèi)皮糖萼。上述結果表明，LSS誘導的內(nèi)皮糖萼降解起因于AMPK失活和NHE1活化。實驗接下來研究了AMPK和NHE1對LSS刺激的HUVECs中HYAL2活化的作用。結果發(fā)現(xiàn)，AMPK和NHE1軸調(diào)控LSS誘導的HYAL2活化。最后，實驗證明Ampkinone處理可防止LSS誘導的左頸總動脈狹窄小鼠糖萼尺寸減少，并且保護內(nèi)皮糖萼延緩左頸總動脈狹窄小鼠內(nèi)皮炎癥的發(fā)展。

總之，這項研究的結果表明，暴露于LSS的內(nèi)皮細胞中AMPK的去磷酸化可能有助于NHE1的激活。后者被認為是一種離子通道蛋白，催化細胞內(nèi) H⁺ 離子和下調(diào)細胞外pH值。酸活性HYAL2降解內(nèi)皮糖萼中的HA，導致內(nèi)皮糖萼變薄。實驗進一步發(fā)現(xiàn)糖萼損傷導致粘附分子VCAM-1和ICAM-1的表達增加，以及巨噬細胞募集到左頸動脈-PL小鼠的內(nèi)皮細胞。因此，特定的糖萼保存，例如刺激AMPK，可能是一種預防早期內(nèi)皮炎癥和抑制動脈粥樣硬化病變形成的新策略。

參考文獻：Zhang J, Kong X, Wang Z, Gao X, Ge Z, Gu Y, Ye P, Chao Y, Zhu L, Li X, Chen S. AMP-activated protein kinase regulates glycocalyx impairment and macrophage recruitment in response to low shear stress. FASEB J. 2019 Jun;33(6):7202-7212. doi: 10.1096/fj.201801869RRR. Epub 2019 Mar 12. PMID: 30860864.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30860864/

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Naturethink平行平板流動腔
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